Hodowle okresowe 2014

Hodowle okresowe 2014, Biotechnologia - Uniwersytet Śląski, Podstawy biotechnologii

s [ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLE OKRESOWEDROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIl. Wstęp teoretyczny.Wzrost drobnoustrojów to przyrost ich objętości, masy, a także podział komórek. Jest onuwarunkowany syntezą materiału komórkowego (białka, kwasy nukleinowe, nukleotydy),tworzeniem nowych organelli komórkowych a także dobudowywaniem nowych struktur do jużistniejących (ściana komórkowa, błona cytoplazmatyczna). Tempo wzrostu drobnoustrojów jestuzależnione od składu podłoża hodowlanego oraz od odczynników fizykochemicznych, takichjak temperatura, pH, potencjał redox. Maksymalny wzrost można osiągnąć tylko wówczas, gdyskładniki podłoża znajdują się w wystarczających ilościach, gdy nie zachodzi limitowaniewzrostu przez któryś ze składników oraz gdy zapewnione są optymalne warunki pH, temperaturyitp. Mówimy wtedy o warunkach wzrostu ,,nieograniczonego”. W hodowli periodycznej(okresowej) warunki takie mają miejsce tylko w początkowym okresie wzrostu. W następnychokresach następuje zmniejszenie stężenia składników odżywczych oraz nagromadzenieproduktów metabolizmu tj. kwasów organicznych czy alkoholi, co wpływa na wzrostdrobnoustrojów.W warunkach hodowli okresowej, gdzie tylko w początkowym okresie ma miejsce wzrostnieograniczony, wyróżnić możemy charakterystyczne fazy wzrostu: fazę przygotowawczą (lag-faza), fazę logarytmicznego wzrostu (log-faza), fazę stacjonarną (równowagi) i fazę zamieraniahodowli.W warunkach wzrostu nieograniczonego, a więc w pierwszej fazie hodowli okresowej,drobnoustroje dzielą się z jednakową szybkością. Liczba ich wzrasta zgodnie z postępemgeometrycznym: 2, 21, 22, 23.. 2n. Jeśli w jednostce objętości hodowli na początku znajdowałosię Nkomórek, to ponpodziałach będzie ich:N = N×2ngdzie:N= ilość początkowa komórek (j.t.k) w godzinie t = 0 (t)N = ilość komórek (j.t.k) po czasie t1, hLogarytmując to równanie otrzymamy:Log N = log N+nlog 2Wyliczając z tego równania liczbę podziałówn,otrzymujemy:n =log N – log Nlog 2Wprowadzając pojęcie częstości podziałówv,czyli liczbę podziałów komórek w ciągu czasut,możemy zapisać,że:nlog N – log N=v=tlog 2 (t – t)gdzie:t- czas w godzinie t = 0, ht1– czas kolejnego pomiaru, hCzas niezbędny dla podziału komórki nazywamy wiekiem osobniczymg.g=t=n1v1KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLE OKRESOWEDROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGII2. Wykonanie.2A. HODOWLA OKRESOWACelemćwiczeniajest sprawdzenieszybkości rozkładu 2-metylofenolu (2-MF)w różnych układach hodowlanych przez szczepAcinetobactersp. w pożywce mineralnej(g/l: Na2HPO4×12H2O, 4; KH2PO4,0,5; NH4Cl, 0,5; MgSO4×7H2O, 0,1; ekstrakt drożdżowy 0,1)z dodatkiem TMS (ang.Trace Mineral Solution)o składzie: FeSO4×7H2O 3,82 g;CoSO4×7H2O 295 mg; MnSO4×H2O 82 mg; ZnSO4×7H2O 141 mg; H3BO36 mg;Na2MoO4×2H2O 40 mg; NiSO4×7H2O 82 mg; CuSO4×5H2O 2,9 mg;Al2(SO4)3×18H2O 148 mg; Na2WO4×2H2O 6 mg.W tym celu należy założyć 4 układy hodowlane o objętości 300 ml, zgodnie z Tabelą Ipo jej uprzednim uzupełnieniu:Tabela IStężenie2-MF,mMObjętość80 mM r-ru2-MF, mlObjętośćObjętośćpożywkiTMS,mineralnej,mlmlObjętośćhodowliszczepu, mlObjętość pożywkimineralnej użyta douzupełnienia objętościhodowli do 300 mlT,°C2,0301,02,0……1,00,30,30,30,32002002002001. W każdej kolbie określić:a. gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przyλ= 600 nmb. stężenie biomasy metodą filtracjic. wyjściowe stężenie 2-metylofenolu poprzez pomiar metodą zp-nitroaniliną.2. Wyniki umieścić w Tabeli I.3. Kolby umieścić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej (zmierzyć temperaturę)lub w 30°C.4. W odstępach 45-minutowych określać:a. gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przyλ= 600 nmb. stężenie 2-MP poprzez oznaczanie metodą zp-nitroaniliną.5. Wyniki umieszczać na bieżąco w Tabeli I.6. Na zakończenie prowadzenia hodowli oznaczyć stężenie biomasy metodą filtracjiUWAGA! Zachować sterylne warunki w trakcie pracy!!!2KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLE OKRESOWEDROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIMETODYKA OZNACZEŃOznaczanie stężenia 2-metylofenolu metodą kolorymetryczną zp-nitroaniliną1. Pobrać sterylnie 1 ml hodowli i umieścić w probówce typu Eppendorf. Zawartość probówkiwirować przez 5 min przy 12000 rpm w temperaturze 4°C.2. Do szklanej probówki miarowej wprowadzić 0,5 ml odwirowanej hodowli (supernatant) albojej odpowiednie rozcieńczenie, tj. na przykład rozcieńczenie 10-krotne uzyskuje się poprzezpobranie 50µlsupernatantu i 450µlwody destylowanej.3. Dodać 2 ml wody destylowanej.4. Wprowadzić 0,5 ml zdwuazowanejp-nitroaniliny(otrzymanej poprzez odbarwienie roztworup-nitroanilinyo barwieżółtejz użyciem 2% NaNO2) –przygotowywać zawsze naświeżo!!!5. Dodać 0,25 ml 10% Na2CO3.6. Wprowadzić 0,5 ml 10% NaOH.7. Uzupełnić probówkę do objętości 5 ml poprzez wprowadzenie 1,25 ml wody destylowanej.8. Jednocześnie przygotować próbęślepąw identyczny sposób, zastępując supernatantodwirowanej hodowli, wodą destylowaną.9. Po wymieszaniu zmierzyć absorbancję przyλ= 550 nm względem próbyślepej.10. Do przeliczeń stężeń 2-MF stosować równanie krzywej kalibracyjnej A = b * cfenolu, gdzie A toabsorbancja przyλ= 550 nm, c2-MFto stężenie 2-metylofenolu w mM, b = współczynnikkierunkowy krzywej kalibracyjnej.Wyznaczanie wzrostu bakterii poprzez pomiar absorbancji przyλ= 600 nmPobrać sterylnie po 1 ml hodowli z każdego układu i zmierzyć absorbancję przy długościfaliλ= 600 nm z użyciem spektrofotometru HELIOS wobec próbyślepej,którą stanowi wodadestylowana.Oznaczanie stężenia biomasy metodą filtracjiPrzesączyć 20 ml zawiesiny drobnoustrojów przez uprzednio wysuszony do stałej masy(s.m.) i zważony filtr membranowy Co-5. Stosować urządzenie do filtracji próżniowej.Filtr z osadem suszyć w temp. 105°C do stałej masy przez 1 godzinę i ponownie zważyć.Stężenie biomasy w g/ml obliczyć ze wzoru:X= (a-b) / Vgdzie:a-masa filtra z osadem, gb-masa filtra, gV - objętość próbki użytej do oznaczenia, mlX - stężenie biomasy, g/mlWyniki umieścić w tabeli III.3KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLE OKRESOWEDROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIWyznaczenie krzywej kalibracyjnej do oznaczania stężenia 2-metylofenoluKrzywą kalibracyjną do oznaczania stężenia 2-metylofenolu wykonać zgodnie z instrukcjądo oznaczania stężenia 2-MF metodą kolorymetryczną zp-nitroanilinąoraz tabelą II. Wynikipomiaru absorbancji przyλ= 550 nm umieścić w tabeli. Na podstawie uzyskanych wynikówwyznaczyć współczynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej.Tabela IIStężenie2-MF,mM0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0V5 mM 2MP,ml0,000,010,020,030,040,050,060,070,080,090,10Woda,ml2,502,492,482,472,462,452,442,432,422,412,4p-nitroanilinazdwuazowana,ml0,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,510%Na2CO3,ml0,250,250,250,250,250,250,250,250,250,250,2510%NaOH,ml0,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,5Woda,ml1,251,251,251,251,251,251,251,251,251,251,25Absorbancja,λ=550 nmL.p.1234567891011Równanie krzywej: ……………………………………………………………………………………….Tabela IIIHodowlaobjętośćprzesączu,mlnrsączkamasasączka, gmasa sączkaz bakteriami, gmasabakterii, gstężeniebiomasy,g/ml2,0301,02,0……1,04KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLE OKRESOWEDROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIWYTYCZNE DO PRZYGOTOWANIA SPRAWOZDANIAZĆWICZEŃ„HODOWLE CIĄGŁE I PERIODYCZNE”Sprawozdanie przygotować należy w postaci prezentacji PowerPoint, nie przekraczającej35 slajdów.1. Slajd tytułowy: tytułćwiczenia,nazwiska i imiona, numery indeksów sprawozdających, grupaćwiczeniowa.2. Celećwiczenia.3. Metodyka pracy i teoretyczne podstawy oznaczeń (z uwzględnieniem krzywej kalibracyjnejdla kolorymetrycznego oznaczania stężenia substratu aromatycznego).4. Wyniki należy przedstawić w postaci tabel oraz wykresów. Wykresy powinny mieć opisaneosie, legendę oraz odpowiednią skalę!!!Należy skomentować otrzymane wynikii zaproponować wnioski adekwatnie do celówćwiczenia.5. Hodowla okresowa:Tabele prezentujące całość wyników, wartościśredniei odchylenia standardowegęstości hodowli i stężenia substratu aromatycznego w czasie;Wykresy zmian gęstości hodowli i substratu aromatycznego w czasie dla wartościuśrednionych dla badanych układów – w tym celu należy wymienić się wynikami z conajmniej dwoma innymi grupami badawczymiZestawienie na jednym wykresie przyrostów gęstości hodowli w każdym z badanychukładów (w obecności różnych stężeń substratu aromatycznego w danej temperaturzeoraz w obecności tego samego stężenia substratu w różnych temperaturach);Porównanie czasu trwania poszczególnych faz wzrostu hodowli w badanychukładach;Zestawienie na jednym wykresie zmian stężenia substratu aromatycznego w każdymz badanych układów (rozkład różnych stężeń substratu aromatycznego w określonejtemperaturze oraz degradacja tego samego stężenia substratu aromatycznego wróżnych temperaturach);Wyznaczenie szybkości rozkładu substratu aromatycznego w różnych temperaturach;8. Przedstawienie obliczeń i wyników zadania teoretycznego „Wyznaczanie wzrostu bakteriimetodą płytkową”.9. Przedstawienie obliczeń i wyników zadania teoretycznego „Zakładanie hodowli ciągłejmikroorganizmów”.10. Samoocena grupy i samoocenaz UZASADNIENIEM tej oceny.poszczególnychstudentówwpostacitabeli5 [ Pobierz całość w formacie PDF ]